Analisi quantitativa lateral flow dell’aflatossina M1: miti e realtà dei nuovi test rapidi

Negli ultimi anni, la tecnologia a flusso laterale ha riscosso sempre maggior successo nello sviluppo di test rapidi per le analisi molecolari dei prodotti lattiero-caseari, in particolare per l’analisi quantitativa della concentrazione di aflatossina M1 nel latte crudo in relazione al MRL (Maximum Residue Limit) fissato dalla legislazione comunitaria.

Le aflatossine sono micotossine prodotte principalmente da due specie fungine (Aspergillus flavus e Aspergillus parasiticus), dotate di potere tossico, cancerogeno e mutageno per gli animali e l’uomo.

In presenza di climi torridi e secchi gli aspergilli colonizzano granaglie, legumi e semi oleosi, rilasciando aflatossine di tipo B e G (principalmente B1). Gli animali da latte, come i bovini, che si nutrono di cereali contaminati, hanno la capacità di trasformare l’aflatossina B1 in aflatossina M1, poi secreta nel latte. Nel 1993, l’IARC, Agenzia Internazionale per la Ricerca sul Cancro, ha inserito l’aflatossina B1 nell’elenco degli agenti cancerogeni per l’uomo, e l’aflatossina M1 come possibile cancerogena, portando di fatto a una estrema sensibilizzazione dell’opinione pubblica dai produttori della filiera lattiero-casearia al consumatore finale. La normativa europea di riferimento in merito alla contaminazione di aflatossina M1 nel latte è il regolamento UE n. 165/2010 che fissa il limite massimo residuo (MRL) di aflatossina M1 a 50 ppt (espressi anche come 50 ng/kg o 0,05 µg/kg) per latte crudo, trattato termicamente o destinato alla fabbricazione di prodotti a base di latte. Campioni di latte con concentrazioni superiori a 50 ppt non sono né commercializzabili né utilizzabili per la lavorazione di prodotti lattiero-caseari. A oggi, la metodologia HPLC rappresenta l’unica tecnologia ufficiale AOAC n. 2000.08 per la misura del tenore di contaminazione da aflatossina nel latte. Si tratta di una strumentazione costosa e ingombrante, gestita da personale tecnico laureato e specializzato e, per questo motivo, è utilizzata in laboratori di analisi accreditati per il controllo qualità alimentare. L’HPLC garantisce la massima specificità, sensibilità e precisione nel risultato, ma ha costi elevati e tempi di analisi troppo lunghi per poter essere utilizzata nelle analisi di routine.

L’alternativa all’HPLC: il test lateral flow

La necessità di un costante quotidiano monitoraggio della contaminazione di AFM1 nel latte ha portato le aziende della filiera lattiero-casearia a dotarsi di metodi di analisi alternativi all’HPLC, ma ugualmente affidabili, possibilmente rapidi e poco costosi da inserire nel proprio piano di autocontrollo in adempimento alle normative vigenti. A tal proposito, negli ultimi 15 anni la tecnologia a flusso laterale (in inglese lateral flow technology) ha trovato sempre maggiore impiego nello sviluppo di test rapidi per le analisi dell’aflatossina M1 nel latte. I test lateral flow hanno numerosi vantaggi rispetto a metodologie concorrenti (come ELISA), quali: elevata specificità e sensibilità verso la specie in esame, rapidità, riproducibilità e precisione delle analisi, costo contenuto e semplicità nell’esecuzione.

Un esempio pratico. Un’analisi ELISA richiede più di un’ora di lavoro, una buona manualità per eseguire i numerosi passaggi del protocollo in piastre da 96 micropozzetti, e uno spettrofotometro. Invece, il test lateral flow fornisce un risultato certo e facile da acquisire in soli 15 minuti, con un solo passaggio ed è ready to use, cioè non necessita la preparazione di reagenti, soluzioni standard, elaborazione di rette di taratura, controlli positivi, negativi, analisi in doppio come invece richiesto dalla metodologia ELISA.

Un esempio di successo

Il test lateral flow prodotto da Charm Science Inc. (US) e distribuito in Italia da Alitest Srl per l’analisi quantitativa dell’aflatossina M1 nel latte è un saggio che si esegue su strip monuso, in un singolo passaggio (addizionare il latte) e può essere svolto anche da personale non qualificato. Il risultato è fornito da un lettore a rifrazione luminosa, portatile, compatto e intuitivo che permette di eseguire il test sia in stalla che sull’autocisterna trasportatrice o in laboratorio, garantendo una flessibilità e maneggevolezza nella gestione delle analisi senza precedenti. Il test Charm MRL Aflatossina M1 Quantitativa è stato validato da ILVO T&V (Instituut voor Landbouw-en Visserjonderzoek Technologie & Voeding), istituto belga di ricerca, nel 2013 come test di screening quantitativo in accordo con la decisione della Commissione 2002/657/CE e le CRL guidelines. Nello studio di validazione il test Charm dimostra alta selettività, ripetibilità, elevata robustezza a variazioni di volume e temperatura del campione, eccellente capacità di detection in un intervallo di quantificazione compreso tra 15 e 100 ppt, con percentuali di falsi negativi e positivi praticamente nulle. Il saggio Charm è stato inoltre validato da Safe Wheat Srl (Bari), Spin-off del CNR-ISPA (Centro Nazionale delle Ricerche – Istituto di Scienze delle produzioni alimentari) di Bari, utilizzando latte contaminato da aflatossina M1 sia naturalmente che artificialmente. In tutte le prove eseguite è stata osservata una buona correlazione (r= 0,915) tra i risultati ottenuti con il test Charm MRL Aflatossina M1 Quantitativa e il metodo HPLC ufficiale AOAC n. 2000.08. Ultimo aspetto, ma non per minore importanza, i test lateral flow, grazie all’evoluzione delle nanotecnologie, hanno inoltre incrementato la loro duttilità, prestandosi non solo ad analisi su latte crudo bovino, ma anche ovino, bufalino, latte in polvere, latte UHT, panna.

Scheda di riferimento. Procedura sintetizzata del test Charm MRL aflatossina M1, validato da Ilvo e CNR Bari. Le immagini sono solo a scopo interpretativo. Per ottenere il valore certo occorre leggere lo strip con il lettore suggerito dalla casa produttrice

Correlazione tra i risultati ottenuti con il test MRL e quelli ottenuti con il metodo AOAC n. 2000.08

Carta d’identità
Charm Science Inc. (Lawrence, MA, USA), azienda leader nel settore delle analisi alimentari, sviluppa dal 1978 test rapidi diagnostici in campo alimentare utilizzando la tecnologia a flusso laterale e li distribuisce in 90 Paesi. Oggi, circa il 75% del latte crudo mondiale (bovino, ovino, caprino, cammello) è testato con i kit di Charm Science Inc. I prodotti Charm sono presenti in Italia dal 1998 e sono distribuiti dall’azienda Alitest Srl (Viadana, Mantova) a più di 300 clienti: dalle aziende agricole, ai caseifici, latterie, centrali del latte e grandi gruppi lattiero-caseari. Ogni tipo di test è stato sottoposto a studi di validazioni internazionali, accompagnato da certificati di qualità e personalizzato in base alle esigenze di qualsiasi cliente. Charm MRL Aflatossina M1 Quantitativa rappresenta uno dei test di punta dell’intero portfolio in quanto consiste di un test rapido che in soli 15 minuti fornisce un’analisi quantitativa certa della concentrazione di aflatossina M1 comparabile all’HPLC. È un test immunoenzimatico che sfrutta la tecnologia del flusso laterale e necessita di un solo semplice passaggio. Il lettore a rifrazione luminosa Charm EZ-Lite (o nella versione precedente Charm ROSA Reader) analizza l’intensità di colorazione delle bande delle linee C e T e attraverso un algoritmo fornisce un risultato quantitativo in meno di 5 secondi. Il dato può essere stampato, archiviato su microSD, salvato su PC ed elaborato con grafici e tabelle su Excel.

 

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