Le ammine biogene (AB) sono basi azotate a basso peso molecolare che si accumulano nel formaggio principalmente attraverso la decarbossilazione microbica degli amminoacidi durante la fermentazione e, soprattutto, la stagionatura. Esse sono distinte dalle ammine prodotte dall’organismo come dopamina, epinefrina, serotonina, aventi importanti funzioni fisiologiche (neurotrasmissione, regolazione della crescita, mediazione dell’espressione genica e dei processi infiammatori, risposta immunitaria, differenziazione cellulare). Sebbene le ammine alimentari siano presenti in genere in piccole quantità, concentrazioni elevate (spesso >100 mg/kg) sono tossiche e causano sintomi come mal di testa, eruzioni cutanee, palpitazioni, disturbi gastrointestinali e ipertensione. La loro assunzione a livelli deleteri si configura come una vera e propria intossicazione alimentare. Tuttavia, affinché la sintomatologia si manifesti in forma critica occorre non solo che la quantità di AB sia elevata ma che, al contempo, vi sia una predisposizione genetica e/o fisiologica dell’organismo a reagire negativamente alla loro ingestione. La legislazione al riguardo è ancora carente. Questo perché è alquanto problematico stabilire intervalli precisi di tossicità a causa della variabile reattività individuale e dei molteplici fattori coinvolti nella sintesi di questi composti. Attualmente non esistono limiti legali armonizzati a livello europeo che fissino i quantitativi massimi di AB nei formaggi. Il regolamento n. 1019 della Commissione UE del 23 ottobre 2013, che modifica l’allegato I del regolamento (CE) n. 2073/2005, definisce i criteri relativi alla presenza di istamina nei prodotti della pesca, con limiti fra 100 e 200 mg/kg, consentito in due campioni su nove, mentre la Food and Drug Administration fissa valori ancora più restrittivi (non >50 mg/kg) per tutti gli alimenti. Tuttavia, non è ancora disponibile una legislazione specifica su tutti i prodotti potenzialmente interessati, inclusi i formaggi, forse anche per carenza di dati epidemiologici robusti che leghino causa ed effetto. L’EFSA e diversi studi suggeriscono livelli tollerabili complessivi di AB nei formaggi, spesso indicando come valore precauzionale per l’istamina un massimo di circa 400 mg/kg, sebbene quantitativi più bassi siano preferibili. Peraltro, se è pur vero che l’istamina è di gran lunga l’ammina biogena più coinvolta in intossicazioni alimentari, da più parti si rileva come altre ammine, es. tiramina, necessiterebbero di attenzione analoga e indicazioni sulle concentrazioni massime consentite. A tal riguardo, la tiramina è spesso monitorata nei formaggi stagionati poiché può accumularsi in quantità anche elevate (> 100-500 mg/kg), causando risposte tossiche o di intolleranza simili alle altre AB.
Struttura chimica e aspetti tossicologici
Le AB possono essere classificate in base alla loro struttura chimica (alifatica, aromatica, eterociclica) o al numero di gruppi amminici (monoammina, diamine, poliammine). Istamina, triptamina, putrescina, cadaverina, feniletilamina (o 2-feniletilamina), tiramina, spermidina e spermina sono quelle più diffuse rilevate negli alimenti. Secondo alcuni autori, spermina e spermidina non sono più considerate “vere” AB a causa della loro origine (non direttamente derivante da amminoacidi) e delle loro basse concentrazioni presenti negli alimenti. La maggior parte delle AB partecipa ad alcune funzioni dell’organismo; per esempio, l’istamina svolge un ruolo importante nelle attività cerebrali, nella regolazione della temperatura corporea e del volume gastrico, mentre la tiramina aumenta la pressione sanguigna come vasocostrittore.
La concentrazione di AB nel corpo umano è regolata da meccanismi biochimici di natura enzimatica. A livello intestinale sono presenti ossidasi in grado di inattivare le AB, formando composti meno tossici. Le ossidasi però non sono egualmente efficienti in tutti gli individui, soprattutto in concomitanza con l’ingestione di farmaci (analgesici, antidepressivi e altri), carenze immunitarie, disfunzioni gastriche o in seguito a consumo di alcol. Inoltre, putrescina e cadaverina possono potenziare la tossicità di istamina e tiramina, portando a potenziali effetti avversi anche in consumatori sani. Infine, l’ingestione di AB attraverso il consumo di formaggi può risultare deleteria per le categorie a rischio (bambini, anziani, donne in gravidanza), ove l’attività detossificante potrebbe essere meno efficiente. Pertanto, la carenza di livelli di assunzione consentiti, o consigliati, di AB negli alimenti, sottolinea ancora una volta la necessità di introdurre criteri e valutazioni quantitative più precisi per le varie categorie di consumo.
Genesi delle AB nei formaggi
Ma perché i microrganismi producono AB nei formaggi? Le ipotesi più accreditate riconducono a meccanismi fisiologici in reazione agli stress incontrati durante la trasformazione e stagionatura dei prodotti. Con la decarbossilazione degli aminoacidi i microrganismi producono le ammine, che sono composti a reazione basica in grado di attenuare lo stress acido; inoltre, la liberazione di CO2 consente di ottenere energia supplementare, preziosa per le cellule batteriche. L’ambiente del formaggio è pertanto incline all’accumulo di AB poiché la spiccata acidità iniziale e, col proseguire della stagionatura, un limitato livello di carboidrati e un ambiente ostile (bassa aw ed elevata pressione osmotica) sono condizioni estreme per una crescita microbica ottimale. Questa reazione permette quindi ai microrganismi di ricavare energia per far fronte alle proprie esigenze fisiologiche e sopravvivere agli stress incontrati in un formaggio durante la stagionatura. Naturalmente, la conditio sine qua non affinché si abbia un accumulo di AB in formaggio, come in altri prodotti fermentati (es. vino), è legata alla capacità dei microrganismi di dissociare il gruppo carbossilico degli aminoacidi, generando l’ammina corrispondente. Tale proprietà è specifica di alcuni gruppi, specie e di determinati ceppi microbici, provvisti nel proprio genoma dei geni deputati a tale attività. Poiché i substrati per avviare le decarbossilazioni sono gli amminoacidi e dato che la quantità corrispondente di AB è proporzionale alla loro concentrazione nei formaggi, ne deriva che i prodotti più propensi a contenere AB sono in genere quelli a medio-lunga stagionatura, a maturazione prevalentemente proteolitica. Ciononostante, non esiste una regola assoluta per prevedere il contenuto di AB nei formaggi. Una disanima dei principali fattori coinvolti nella produzione di queste molecole potrebbe aiutare a fornire un indizio sul grado di contaminazione. Per esempio, il tempo di maturazione favorisce il rilascio dei precursori (gli aminoacidi) in virtù del procedere dei fenomeni proteolitici legati all’autolisi microbica, con conseguente rilascio di proteasi e peptidasi intracellulari. Anche la composizione del microbiota nella materia prima potrebbe influenzare l’accumulo di AB grazie alla possibile presenza di un’elevata quantità di gruppi microbici dotati di attività decarbossilasica. Non ultimi, la tecnologia produttiva, l’ambiente di maturazione e la gestione del prodotto potrebbero influenzare le dinamiche microbiche, portando a un prodotto più o meno contaminato. Teoricamente, quindi, i formaggi freschi dovrebbero contenere meno AB rispetto a quelli maturi, così come è prevedibile che i prodotti a latte crudo possano veicolare maggiori quantità di AB rispetto a quelli a latte pastorizzato. Con alcune eccezioni, nella maggior parte dei casi questa previsione è confermata analiticamente.
Microbiota coinvolto
I batteri sono principalmente responsabili della produzione di AB grazie alla loro abbondanza, attività e alla presenza dell’enzima decarbossilasi nel loro genoma. In linea generale, le concentrazioni più elevate di AB si osservano in concomitanza con densità microbiche rilevanti (>7 log ufc/g). Tra i formaggi, quelli caratterizzati da lunghi processi di maturazione, con una successione di microrganismi provenienti da colture starter, da microbiota non-starter e da contaminanti, sono quelli con la più ampia casistica. Infatti, la durata della stagionatura influenza l’accumulo di AB rispetto ai formaggi freschi a causa del rilascio di amminoacidi liberi durante il processo di proteolisi. Inoltre, più il microbiota è complesso, maggiore è la probabilità che specie produttrici di AB siano presenti. La complessità ed eterogeneità del microbiota sono peraltro intimamente connesse alla qualità della materia prima e ai trattamenti termici applicati (latte crudo, pastorizzato o termizzato). Utilizzando latte crudo nella produzione del formaggio è infatti plausibile trovare batteri autoctoni che, sebbene possiedano attività biochimiche utili nella definizione della qualità dei prodotti potrebbero, allo stesso tempo, contribuire alla produzione e all’accumulo di AB. Molti formaggi tradizionali prodotti con latte crudo mostrano, in media, un contenuto di AB superiore rispetto a prodotti con tecnologia simile, ma ottenuti da latte pastorizzato.
La tiramina, la principale ammina presente nei prodotti lattiero-caseari, è prodotta principalmente da batteri Gram-positivi fra cui lattobacilli (Levilactobacillus brevis, Lb. reuteri, Lacticaseibacillus casei), lattococchi (Lactococcus lactis subsp. lactis e cremoris) ed enterococchi (Enterococcus faecalis, faecium, durans). Tra i batteri Gram-negativi, Pseudomonas, Citrobacter ed E. coli rappresentano certamente i principali taxa responsabili della sintesi di AB, rinvenibili in latte e formaggi. Diversi studi mostrano una correlazione diretta fra la presenza di alte densità di Enterococcus spp. nel latte e il contenuto di tiramina nel formaggio. Per quanto riguarda l’istamina, che è la seconda AB ritrovabile con maggior frequenza nei formaggi, essa può essere prodotta principalmente sia da Gram-positivi che da Gram-negativi. Fra i primi, S. thermophilus, Lent. parabuchneri, Lent. buchneri, Lat. curvatus, Lat. sakei, L. helveticus), Cl. perfringens e St. xylosus sono fra i principali produttori di istamina. Occorre sottolineare che all’interno delle succitate specie, molte delle quali ampiamente diffuse negli starter selezionati o naturali utilizzati per la produzione di numerosi formaggi della tradizione casearia nazionale, solo un limitato numero di ceppi è dotati di attività istamina decarbossilasica. D’altra parte, è stato spesso osservato un effetto sinergico di produzione di AB fra specie lattiche differenti, es. fra S. thermophilus e lattococchi, con i secondi che, in virtù di una spiccata attitudine proteolitica, potrebbero accumulare elevate quantità di aminoacidi liberi, fornendo a S. thermophilus i precursori per la sintesi di AB. Pertanto, potrebbe essere ipoteticamente utile cercare starter, o colture integrative, prive dei geni della decarbossilasi. L’eliminazione di questi ceppi nella formulazione di starter mediante test di laboratorio sarebbe agevole qualora si trattasse di colture selezionate, mentre risulterebbe più problematica per le colture indefinite, soggette a continue fluttuazioni nella composizione microbica, legate alla qualità del latte, da cui tali colture sono preparate. Klebsiella, Enterobacter e Pseudomonas putrefaciens sono le specie istamina-produttrici più frequenti all’interno dei batteri Gram-negativi. Da notare però che questi microrganismi sono generalmente eliminati con i trattamenti di risanamento del latte qualora trattasi di formaggi a latte pastorizzato, mentre per quanto riguarda i prodotti a latte crudo essi, facendo parte del microbiota indicatore del livello igienico della materia prima, rientrano fra i gruppi microbici da contenere in ossequio ai criteri di igiene di processo in accordo al regolamento (CE) n. 2073/2005 (e successive modifiche); inoltre, la maggior parte di questi microrganismi viene inattivata dall’azione dello starter e durante la maturazione, inibendo l’accumulo di istamina e altre AB nei formaggi a latte crudo a lunga stagionatura.
