Conteggio di verocitotossici E. coli (VTEC) O157 e O26 in latte mediante PCR quantitativa
di Rocco Mancusi e Marcello Trevisani, Department of Veterinary Medical Science, Università Alma Mater Studiorum di Bologna (pp. 121-127)
La PCR quantitativa real-time (qPCR) può essere una conveniente alternativa ai metodi Most Probable Number (MPN) per contare i batteri VTEC in latte. Il numero di VTEC è normalmente molto basso nel latte; quindi, al fine di aumentare la sensibilità, è stato sviluppato un metodo basato sulla qPCR che prevede un passaggio preliminare di arricchimento. È stato studiato il pattern di crescita di sei ceppi VTEC (sierogruppi O157 e O26) dopo arricchimento in acqua peptonata tamponata (BPW, Buffered Peptone Water) con o senza acriflavina per 4-24ore. I campioni di latte sono stati inoculati con questi ceppi utilizzando un intervallo di concentrazioni di cinque Log tra 0,24-0,50 e 4,24-4,50 Log ufc/ml. Il DNA è stato estratto dai campioni arricchiti in duplicato e ogni estratto è stato analizzato in duplicato via qPCR con coppie di primer specifici per i sierogruppi O157 e O26. Quando i campioni erano pre-arricchiti in BPW a 37°C per 8 ore, il rapporto tra cicli soglia (valori CT) e numeri Log VTEC era lineare lungo un intervallo di concentrazione di cinque Log. L’analisi da regressione dei numeri di cicli soglia PCR su VTEC Log ufc/ml ha indicato una differenza di 10 volte del numero di copie di geni tra campioni (con una efficienza PCR 100±10%). La stessa proporzione di 10 volte usata per inoculare i campioni di latte con VTEC, è stata osservata anche nei campioni arricchiti 8 ore. Un confronto tra valori CT di campioni di latte e controlli ha rivelato che i ceppi inoculati nel latte crescevano di 3 Log durante il periodo di arricchimento di 8 ore. L’analisi di regressione dei dati qPCR e MPN ha rivelato che l’errore delle stime con la qPCR è inferiore a quello del MPN. Le verifiche comparative dei tassi di crescita possono essere fatte usando misurazioni spettrofotometriche di colture standardizzate di isolati e di ceppi di riferimento coltivati in BPW a 37°C per 8 ore. Il metodo sviluppato per i sierogruppi O157 e O26 può essere facilmente adattato ad altri sierogruppi VTEC rilevanti per la salute umana. Il metodo qPCR è meno laborioso e più rapido del metodo standard MPN ed è risultato una tecnica affidabile per quantificare i VTEC in latte.
Bibliografia
International Journal of Food Microbiology. 1° agosto 2014, vol. 184.
