I batteriofagi dei batteri lattici: problemi e soluzioni

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Formaggi

La selezione industriale di ceppi resistenti e la rotazione fagica

Lo conoscenza dello spettro di resistenza ai fagi dei ceppi di una data collezione di batteri lattici (o tipizzazione fagica) è fondamentale per il produttore di fermenti ed è uno dei sistemi per caratterizzare una ceppoteca industriale. La tipizzazione si basa sulla disponibilità di un’ampia collezione di fagi, con i quali infettare i ceppi da caratterizzare. La mancata lisi del ceppo dopo opportuna incubazione testimonia la resistenza a quello specifico fago. La tipizzazione è tanto più efficace quanto più ampia e fenotipicamente e geneticamente diversa è la collezione di batteriofagi a nostra disposizione. Nel caso di impiego di colture starter selezionate è importante che esse siano costituite da più ceppi microbici a diversa sensibilità e che sia adottata in caseificio una strategia di avvicendamento delle colture (“rotazione” fagica).

La rotazione, unico approccio veramente efficace per far fronte alla sopra accennata capacità dei virus di sconfiggere tutte le difese dell’ospite, rappresenta tuttora il metodo più applicato e proposto dai produttori di fermenti per la prevenzione e il controllo delle infezioni in caseificio. La rotazione consente di mantenere la presenza dei fagi a livelli bassi non pericolosi ai fini dell’attività della coltura poiché è basato sull’avvicendamento periodico di colture starter tecnologicamente simili, composte cioè da ceppi con le stesse proprietà di interesse caseario (es. capacità acidificante, proteolisi, produzione di aromi) ma caratterizzate da diversa sensibilità fagica.

Il risultato della rotazione è di mantenere a livelli costantemente bassi tutti i possibili biotipi fagici presenti in quel determinato ambiente, garantendo le performance produttive. L’abbinamento della rotazione all’impiego ormai usuale in caseificio della tecnologia a inoculo diretto in caldaia minimizza ulteriormente i rischi di infezione fagica. L’impiego di starter diretti consente infatti di evitare i passaggi di preparazione della coltura, riducendo la possibilità di contaminazione e replicazione virali.

Figura 1 – Microfotografia al microscopio elettronico di batteriofagi: fago temperato di Lactobacillus delbrueckii (a)
Figura 1 – Microfotografia al microscopio elettronico di batteriofagi: fago temperato di Lactobacillus delbrueckii (a)

La ricerca di varianti resistenti: quando la tipizzazione non basta

La selezione per tipizzazione è basata su un essenziale pre-requisito: l’individuazione di ceppi o varianti che, ancorché resistenti ai fagi, posseggano le medesime attitudini tecnologiche del ceppo originario (capacità acidificante, proteolisi, produzione di aromi, proprietà probiotico- funzionali…). Non sempre però è possibile individuare ceppi con siffatte caratteristiche, soprattutto quando, come nel caso di colture ad attività probiotica, lo starter è composto da un singolo ceppo dotato di più proprietà contemporaneamente (es. capacità di adesione intestinale, resistenza all’acido, alla bile, produzione di batteriocine…).

In tal caso, molto spesso si ricorre alla selezione in laboratorio, che consiste nel porre a contatto il ceppo di interesse con uno o più fagi attivi sul ceppo stesso e, dopo incubazione e lisi, nel cercare di isolare in piastra sottopopolazioni resistenti. Le varianti resistenti vengono poi purificate e testate in laboratorio per valutarne la resistenza ai batteriofagi e, contemporaneamente, il mantenimento delle proprietà di interesse. Tali varianti potranno poi essere utilizzate in rotazione con le stesse modalità sopra descritte.

Figura 1 – Microfotografia al microscopio elettronico di batteriofagi: fago litico di Lactobacillus plantarum (b)
Figura 1 – Microfotografia al microscopio
elettronico di batteriofagi:
fago litico di Lactobacillus plantarum (b)

La lisogenia: quando il nemico è “in casa”

A volte succede che, pur avendo osservato tutte le precauzioni possibili (pulizia e igiene, tipizzazione fagica, rotazione dei ceppi) la coltura possa andare incontro a un rallentamento della crescita a causa di un’infezione fagica. Infatti, molto spesso alcuni batteriofagi (detti “temperati”) attuano il ciclo lisogenico: una volta iniettato, il DNA del virus si integra nel cromosoma dell’ospite infettato in un sito specifico del cromosoma (profago); a questo punto il DNA virale è replicato con quello batterico e, così facendo, ospite e parassita garantiscono la sopravvivenza reciproca. La condizione di lisogenia è instabile e il profago a volte può, spontaneamente o per induzione da eventi chimici o fisici, liberarsi dal DNA batterico e iniziare un ciclo litico di replicazione portando alla formazione di nuovi fagi che lisano la cellula ospite.

Pertanto lo stato di lisogenia di un ceppo di interesse industriale è tecnologicamente molto insidioso in quanto, in qualunque momento, la coltura può essere infettata dal fago temperato. La ricerca di ceppi lisogeni dovrebbe essere uno dei test più importanti di caratterizzazione dei ceppi industriali; in laboratorio può attuarsi attraverso induzione del fago temperato con mezzi chimici (mitomicina C), fisici (calore, raggi UV) o mediante ricerca di geni fagici specifici applicando la biologia molecolare. I ceppi lisogeni di una collezione non dovrebbero essere utilizzati industrialmente.

Figura 2 – Coltura batterica infettata da batteriofagi. Sono visibili le aree di lisi, o placche, dove i batteri sono stati lisati dal virus. Le placche si possono contare e consentono la conta dei fagi
Figura 2 – Coltura batterica infettata da batteriofagi. Sono visibili le aree di lisi, o placche, dove i batteri sono stati lisati dal virus. Le placche si possono contare e consentono la conta dei fagi

La conta dei batteriofagi

Per la programmazione di strategie di prevenzione e controllo è importante la messa a punto di nuove tecniche rapide e attendibili per enumerare, isolare e caratterizzare i batteriofagi presenti in caseificio. Il conteggio dei batteriofagi nelle matrici alimentari si effettua abitualmente in terreno agarizzato sulla base del numero di placche di lisi formatesi su uno strato di cellule sensibili. Un’eccezione è costituita dai fagi di lattobacilli termofili, che spesso non formano placche di lisi su terreno agarizzato, rendendone difficile la conta diretta.

Questa limitazione, peraltro molto diffusa, risulta fortemente problematica per l’industria casearia italiana, in quanto la maggior parte delle tecnologie nazionali prevede l’utilizzo di colture lattiche termofile (optimum 37-45°C), costituite da S. thermophilus da solo o in associazione con lattobacilli termofili (L. helveticus, L. delbrueckii subsp. bulgaricus e subsp. lactis; Lactobacillus fermentum). Presso il gruppo di Microbiologia di CRAFLC è stato recentemente applicato con successo un metodo di microscopia in epifluorescenza per la conta di batteriofagi di batteri lattici (Zago et al., 2012), che consente di superare i limiti della conta in piastra. La tecnica risulta una valida alternativa al metodo delle placche di lisi e consente una stima molto precisa delle particelle fagiche.

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– Suárez V., Zago M., Quiberoni A., Carminati D., Giraffa G., Reinheimer J. Lysogeny in Lactobacillus delbrueckii strains and characterization of two new temperate prolate-headed bacteriophages. Journal of Applied Microbiology 105, 1402-1411 (2008).
– Garneau J.E., Moineau S. Bacteriophages of lactic acid bacteria and their impact on milk fermentations. Microbial Cell Factories, 10 (Suppl 1), S20 (2011).
– Guglielmotti D.M., Mercanti D.J., Reinheimer J.A., Quiberoni Adel L. Review: efficiency of physical and chemical treatments on the inactivation of dairy bacteriophages. Frontiers Microbiology 2, 1-11 (2012).
– Carminati D., Zago M., Giraffa G. Ecological aspects of phage contamination in natural whey and milk starters. In: Bacteriophages in Dairy Processing, Quiberoni A. & Reinheimer J. A. (Editori). Nova Science Publishers, pp. 79-98 (2012).
– Zago M., Scaltriti E., Fornasari M. E.,Rivetti C., Grolli S., Giraffa G., Ramoni R., Carminati D. Epifluorescence and atomic force microscopy: two innovative applications for studying phage-host interactions in Lactobacillus helveticus. Journal of Microbiological Methods 88, 41-46 (2012).

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